神經(jīng)組織的再生是困擾醫(yī)學界的難題之一，近年來科學家發(fā)現(xiàn)成人中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都有神經(jīng)干細胞（neural stem cell, NSC）的存在，但大部分NSC處于靜止狀態(tài)，從體內(nèi)分離、激活NSC，具有非常廣闊的生物學研究和臨床應用前景，已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病研究的焦點。本文擬就NSC研究的新進展及其應用前景綜述如下。

　　1  NSC的分布

　　1992年Reynolds等［1］和Richards等［2］先后從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC,首先打破了成體哺乳動物神經(jīng)細胞不能再生的傳統(tǒng)觀念。成體哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在兩個NSC聚集區(qū)：側腦室壁的腦室下層（sub ventricular zone, SVZ）和海馬齒狀回的顆粒下層（sub granular zone, SGZ）［3］。用免疫熒光標記SVZ的干細胞，在活體可以清晰地觀察到增殖的細胞從腦室遷移到嗅球的軌跡［4］；SGZ的干細胞則發(fā)育形成顆粒細胞,并與海馬齒狀回建立突觸［5］。在人胚NSC的研究，已從大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、腦室沿線包括側腦室、第三腦室和第四腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓、視網(wǎng)膜中分離得到NSC，或具有比NSC更明確發(fā)展方向的神經(jīng)祖細胞。

　　2  NSC的基本生物學特性

　　Mckay［6］于1997年提出，NSC是指具有分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞。其生物學特性主要有以下幾方面。

　　2.1  自我更新  NSC具有高度增殖和自我更新以維持自身數(shù)目恒定的能力。通過兩種方式實現(xiàn),對稱分裂：干細胞分裂產(chǎn)生的兩個子細胞都是干細胞；不對稱分裂：干細胞分裂產(chǎn)生一個干細胞和一個分化的子代細胞,后者終分化為終末細胞。NSC增殖，互相聚集成神經(jīng)球,根據(jù)大小和培養(yǎng)的時間，神經(jīng)球可含有NSC、正在分化的神經(jīng)前體細胞、凋亡細胞,甚至已分化的神經(jīng)元和膠質細胞等。NSC繼續(xù)增殖,則生長出許多子代的神經(jīng)球［7］。Vescovi等［8］報道,NSC可在體外持續(xù)傳代達3年以上，分裂后的子代干細胞具有與母代干細胞*相同的生物學特性。

　　2.2  多潛能分化  NSC分化后可形成神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,其分化與局部微環(huán)境密切相關。目前NSC的誘導分化可通過生長因子誘導、基因調控及信號傳導通路調節(jié)等途徑。

　　2.3  遷移功能和良好的組織融合性  在人類和哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中, NSC沿著發(fā)育索方向遷移。移植后的NSC同樣具有遷移能力,且受病變部位神經(jīng)源性信號的影響,移植后的NSC具有向病變部位遷移的趨化性,并分化成特異性細胞［9］。腦室內(nèi)移植的NSC可以通過血腦屏障,遷移至腦實質中與宿主細胞在形態(tài)結構和功能上形成初步良好的整合,參與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡形成。

　　2.4  高度未分化狀態(tài)及低免疫原性  NSC增殖能力處于較原始的未分化狀態(tài),呈巢蛋白（nestin）陽性,缺乏已分化細胞的抗原標志,無成熟細胞相應的特異性標志，不表達成熟細胞的抗原,具有低免疫原性,在移植后較少發(fā)生異體排斥反應,利于其存活［10］。

　　2.5  轉分化和去分化  Bjornson等［11］發(fā)現(xiàn)小鼠NSC植入同種異體血管內(nèi)可逆轉分化成血細胞。Clarke等［12］將Lac-z標記的小鼠NSC移入雞和小鼠囊胚中,可逆轉分化成為內(nèi)中外3個胚層,經(jīng)研究證實利用NSC可實現(xiàn)跨胚層分化,如分化為骨骼肌細胞及造血系統(tǒng)的各系細胞等。但隨著研究的深入,越來越多的科學實驗發(fā)現(xiàn)的事實和成體組織中存在成體干細胞的證據(jù),向“橫向分化”、“跨胚層分化”學說等提出質疑, Nature（2004）刊登了兩個不同實驗室的2篇論著 ［13,14］，各自用充分的事實證明,輸注的CD34+造血干細胞到達損傷的心肌部位卻仍然分化為CD45+造血細胞,而沒有變?yōu)樾募〖毎娜魏巫C據(jù)。

　　3  NSC的來源、分離、培養(yǎng)及鑒定

　　3.1  NSC的來源  NSC主要從以下幾種途徑獲得：（1）來源于神經(jīng)組織［15］;（2）來源于胚胎干細胞、胚胎生殖細胞等細胞的定向誘導分化［16］;（3）來源于血液系統(tǒng)的骨髓間質干細胞［17］、成年多能祖細胞［18］及臍血細胞［19］;（4）來源于永生化細胞系 C17-2細胞系［20］（由新生小鼠小腦外顆粒層細胞通過逆轉錄病毒轉導V-Myc后獲得的克隆多能干細胞系）、MHP36細胞系［21］（從轉導溫度敏感型tsA58原癌基因的轉基因小鼠的海馬增殖區(qū)獲得，是一種溫控型NSC。在體外33℃時增殖，在體內(nèi)較高溫度37℃時分化成神經(jīng)元和膠質細胞）、NT2細胞系［21］（從人睪丸生殖細胞腫瘤中獲得，在維甲酸的誘導下表現(xiàn)出NSCs的特性）;（5）體核細胞轉移技術獲得NSC ［22］。

　　3.2  NSC的分離純化方法  目前建立起的NSC的分離方法有：（1）反復傳代法。取3～4個月齡的人胚胎紋狀體或孕 14～16天小鼠、大鼠胚胎大腦，機械分離制作單細胞懸液。在含多種神經(jīng)因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實現(xiàn)NSC的體外穩(wěn)定有效擴增。經(jīng)過長期培養(yǎng)反復傳代可使NSC得到純化。（2）流式細胞術。Sasaki等［23］采用流式細胞儀對約60種細胞表面抗原進行篩選，結果發(fā)現(xiàn)分選出的具有CD133+/CE34+/CD45-（細胞表面抗原）的細胞為NSC。（3）基因轉導。Keyoung ［24］等利用腺病毒為載體,將置于歸巢素和Msi1增強子和啟動子控制下的綠色熒光蛋白基因導入人胚胎細胞,然后對胚胎細胞進行體外培養(yǎng),只有NSC能特異性地出現(xiàn)綠色熒光蛋白。再利用流式細胞儀進行熒光篩選,能進一步將NSC收集起來。（4）免疫磁珠細胞分選法。利用磁珠表面的特異性抗體與NSC表面抗原結合，在磁場作用下使結合磁珠的NSC與其他細胞分離，從而得到較純化的NSC。

　　3.3  NSC的鑒定  巢蛋白（Nestin）是一種神經(jīng)元中間絲蛋白［25］,其表達始于神經(jīng)胚形成時,當NSC遷移基本完成,巢蛋白的表達量逐漸減少,并隨NSC分化的完成停止表達。免疫組化證實NSC均呈Nestin陽性。Okano等［26］鑒定出一種RNA結合蛋白即 Musashi ,可作為NSC的標志物。對分離培養(yǎng)得到的NSC進行標記時發(fā)現(xiàn),Nestin和Musashi呈雙重陽性,且隨著NSC分化成為神經(jīng)元,二者的標記作用也消失,說明Musashi具有與Nestin相似的特異性和種間保守性。Nestin和Musashi作為早期原始神經(jīng)細胞的標志物已被廣泛地應用于NSC的鑒定。

　　4  NSC的應用前景

　　4.1  NSC原位誘導  內(nèi)源性NSC的自身激活。大量體外和在體實驗已經(jīng)證實成年腦中存在NSC。研究影響NSC增殖和分化的信號作用的實驗［27］證實,腦室管膜下區(qū)等部位的NSC在腦損傷發(fā)生后能夠增殖、遷移到受損部位并分化成新的神經(jīng)細胞，取代受損腦組織細胞。在大多數(shù)情況下,僅由內(nèi)源性干細胞產(chǎn)生的神經(jīng)組織可能不足以替代損傷后缺失的神經(jīng)組織,尤其在脊髓、紋狀體等神經(jīng)組織發(fā)生很少的部位［28］。可能原因有：（1）原位誘導出功能特異的神經(jīng)元可能需要多種刺激和特定細胞因子的作用。（2）患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞缺陷或無法激活。

　　4.2  異體神經(jīng)干細胞移植  臨床試驗表明,移植胎兒腦組織治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可以明顯改善癥狀。但胎腦的來源有限,受倫理和法律上的束縛,限制研究的發(fā)展。NSC的發(fā)現(xiàn)和體外分離培養(yǎng),為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞替代療法拓寬了道路。在體外培養(yǎng)擴增的NSC移植到腦疾病動物模型腦內(nèi)的實驗［29］表明,體外培養(yǎng)的NSC移植到腦內(nèi)后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細胞,其分化方向與所處的微環(huán)境密切相關。Vescovi等［30］在研究細胞移植治療帕金森病時發(fā)現(xiàn),在體外實驗中沒有必需的因素干預下, NSC自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細胞總數(shù)的0.5%～5%。因此,誘導NSC向修復所需的神經(jīng)功能（目的）細胞分化成為研究的核心問題。

　　4.3  基因治療  基因治療是通過特定載體相關外源基因導入體內(nèi),使其獲得表達,達到治療由于某種基因缺陷或突變引起的疾病。目前神經(jīng)系統(tǒng)基因治療常用的靶細胞有：（1）成纖維細胞,來自間充質,能在體外分裂增殖,具有較高的病毒感染率但植入腦后不能與宿主整合；（2）永生化神經(jīng)祖細胞,體外容易進行基因轉導和能與宿主整合等優(yōu)點,但存在致癌的危險；（3）NSC來源于神經(jīng)組織,比永生化NSC更能保持原有的生物學特性,具有分化能力和更好的組織相容性,可以整合到宿主腦組織并向周圍遷移,不形成腫瘤等。

　　4.4  NSC的其他應用  NSC具有穩(wěn)定的生物學性狀,建系以后可以獲得均一的遺傳背景,具有組織和種屬特異性，可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺。利用NSC的多向分化潛能,可篩選出控制和促進NSC向終末細胞分化的藥物。另外,利用攜帶報告基因的逆轉錄病毒轉染腦內(nèi)可增殖細胞來追蹤神經(jīng)前體細胞的分布、增殖分化和遷移情況,研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。