NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒

商品貨號：QS1002
英文名稱：NAD-Malate Dehydrogenase（NAD-MDH）Assay Kit
別名：NAD-蘋果酸脫氫酶試劑盒 NAD-MDH Kit NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒 NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）測試盒
檢測方法：常量法

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測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

貨號：QS1002                                           規(guī)格：50管/48樣

NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）試劑盒說明書

紫外分光光度法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理：

NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

自備實驗用品及儀器：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一: 提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑二: 液體50 mL×1瓶，在4℃保存；

試劑三: 粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四: 粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。
2. 將試劑二在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。
3. 操作表：

將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應1min后的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A1-A2小于0.5，可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。

NAD-MDH活力單位的計算：

1、血清（漿）NAD-MDH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NAD-MDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

NAD-MDH（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V樣÷V樣總）÷T=3.215×ΔA

V反總：反應體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；2000：細胞或細菌總數(shù)，2000萬。