瓊脂糖凝膠中回收基因片段
實驗原理
限制性內(nèi)切酶切割后的DNA*片斷經(jīng)過電泳后,按分子量大小被分開,排列在瓊脂糖凝膠中,可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來,加熱或用特殊的試劑熔解凝膠,使DNA溶回到溶液中,再經(jīng)過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的 DNA酶切片段。
實驗試劑
1. 電泳緩沖液
2. 熒光染料
3. 電泳級瓊脂糖粉
4. 10´加樣緩沖液
5. DNA分子量標準(DL2000)
6. DNA凝膠回收試劑盒
實驗設備
1. 旋渦混合器
2. 微量移液取樣器
3. 移液器吸頭
4. 1.5ml 微量離心管
5. 雙面微量離心管架
6. 臺式離心機
7. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
8. 微波爐
9. 恒溫水浴
實驗步驟
1. 配制TAE電泳緩沖液(10´儲存液),10´加樣緩沖液,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。
2. 操作步驟
1) 用1´TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。
2) 在膠上選定兩個加樣孔,分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產(chǎn)物,電泳。
3) 電泳結束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣),在紫外燈下找到目的DNA 帶,用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。注意:含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用加熒光染料,也不用紫外燈照射!
4) 將做好標記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊,根據(jù)小膠條上的標記估計未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置,用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠),轉移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。
5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說明,純化回收目的片段。
純化/回收試劑盒組成:
溶液A:6M NaClO4,0.03M NaAc,pH5.2,少量酚紅;
溶液B:3M NaAc;
溶液C:用時加入35ml無水乙醇;
溶液D:TE緩沖液。
膠回收步驟如下:
a. 將切下的膠帶放入1.5ml離心管中,按照1:3 (膠帶重量:溶液A的體積)的比例加入溶液A;
b. 50℃水溶10min,膠帶*要求*溶化,其間可振蕩助溶2~3次,待溶化后置室溫加入15μl溶液B,充分混勻;
c. 將溶液置于離心柱中,靜置2min,10000rpm離心20s;
d. 倒掉液體,加入500μl溶液C于離心柱中10000rpm離心20s,棄液體,重復該步驟一次;
e. 12000rpm離心1min,甩干剩余液體以除去殘余乙醇;
f. 將離心柱置于新的離心管中,室溫敞開離心管蓋放置5~10min,使乙醇揮發(fā)殆盡;
g. 加入20~30μl溶液D(使用前50℃水浴),靜置2min;
h. 12000rpm離心1min,管底溶液即為所需DNA,將DNA貯存于-20℃可長期保存。